matlabcnv函数,使用CNVkit进行CNV分析

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CNVkit是一款CNV预测软件&＃xff0c;适用于全外显子&＃xff0c;目的区域靶向测序等数据的CNV检测&＃xff0c;官网如下

https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/

被很多高分文章引用&＃xff0c; 示意如下

文章发表在PLos上&＃xff0c;链接如下

https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id&＃61;10.1371/journal.pcbi.1004873

和Excavator类似&＃xff0c;CNVKit也将基因组划分为in-target和off-target两部分&＃xff0c;流程图示意如下

将in-target和off-target区域划分成小的bin区间&＃xff0c;统计bin区间内的测序深度&＃xff0c;综合考虑GC含量&＃xff0c;目的区域的大小和分布密度&＃xff0c; 重复元件等因素&＃xff0c;对原始测序深度进行校正&＃xff0c;然后计算相对对照样本的log2 ratio, 通过segmentation算法来划分segment, 支持cbs, haar, flasso多种segmentation算法。

CNVkit采用python进行开发&＃xff0c;使用方便&＃xff0c;集成了可视化功能&＃xff0c;可以直观的展示分析结果&＃xff0c;支持导出多种格式的结果文件&＃xff0c;可以很好的与下游软件相结合。采用了模块化的开发思想&＃xff0c;按照功能拆分成了独立的模块&＃xff0c;示意如下

每个功能模块对应一个子命令&＃xff0c;为了方便调用&＃xff0c;将pipeline的完整功能封装在batch子命令中&＃xff0c;只通过这一个命令来运行整个pipeline。整个数据分析的过程可以分为以下几个部分

1.  输入区域文件

对于靶向测序而言&＃xff0c;肯定需要输入目的区域的文件&＃xff0c;格式为bed&＃xff0c; target子命令用于处理目的区域的bed文件&＃xff0c;可以添加对应的基因注释等信息&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py target \

my_baits.bed \

--annotate refFlat.txt \

-o my_targets.bed

除了目的区域in-target&＃xff0c;还需要计算off-set区域&＃xff0c;也称之为antitarget,  in-target和off-target区域加起来就是基因组上所有可覆盖的区域。二测测序并不能达到100%的覆盖度&＃xff0c;基因组上的高重复区域&＃xff0c;端粒&＃xff0c;着丝粒等区域就无法覆盖&＃xff0c;所以cnvkit通过access子命令来计算基因组上可以覆盖到的区域&＃xff0c;命令如下

cnvkit.py access \

hg19.fa \

-x excludes.bed \

-o access.hg19.bed

计算出可覆盖的区域之后&＃xff0c;减去in-target区域&＃xff0c; 就可以得到off-target区域&＃xff0c;通过antitarget子命令来实现&＃xff0c;代码如下

cnvkit.py antitarget \

my_targets.bed \

-g access.hg19.bed \

-o my_antitargets.bed

2. 计算样本的测序深度

coverage和autobin两个子命令都可以用来计算测序深度&＃xff0c;以coverage为例&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py coverage \

Sample.bam \

my_targets.bed \

-o Sample.targetcoverage.cnn

cnvkit.py coverage \

Sample.bam \

my_antitargets.bed \

-o Sample.antitargetcoverage.cnn

分别统计target和antitarget区域的测序深度信息&＃xff0c;输出结果后缀为cnn,是cnvkit中定义的一种格式&＃xff0c;专门用来存储测序深度信息。

3. 构建正常基因组的测序分布模型

通过reference子命令来构建正常基因组的测序分布模型&＃xff0c;采用对照样本的测序深度&＃xff0c;校正GC含量等系统误差。有多个对照样本时&＃xff0c;可以将所有的对照样本合并来创建&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py reference \

*coverage.cnn \

-f hg19.fa \

-o Reference.cnn

当没有对照样本时&＃xff0c;软件可以模拟出一个正常的测序深度分布模型&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py reference \

-o FlatReference.cnn \

-f hg19.fa \

-t my_targets.bed \

-a my_antitargets.bed

4. 计算实验样本相对正常对照的log2 ratio

通过fix子命令计算log2 ratio&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py fix \

Sample.targetcoverage.cnn \

Sample.antitargetcoverage.cnn \

Reference.cnn \

-o Sample.cnr

输出结果后缀为cnr, 是cnvkit中定义的一种格式&＃xff0c;专门用来存储log2ratio的信息。

5. 划分segment, 计算拷贝数

通过segment子命令进行segment的划分&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py segment \

Sample.cnr \

-o Sample.cns

输出结果后缀为cns, 是cnvkit中定义的一种格式&＃xff0c;和SEG格式类似&＃xff0c;用来存储CNV分析的结果。接下来还可以通过call子命令&＃xff0c;计算每个segment区域的绝对拷贝数&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py call \

Sample.cns \

-o Sample.call.cns

关于各种文件格式的具体解释可以参考以下链接

https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/fileformats.html

6. 结果可视化

提供了以下3种可视化的子命令

diagram

scatter

heatmap

diagram用于展示单个样本的CNV在染色体上的分布&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py diagram \

-s Sample.cns \

Sample.cnr

可视化结果如下

scatter子命令展示单个样本染色体区域上log2 ratio值的分布&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py scatter \

-s Sample.cns \

Sample.cnr

可视化结果示意如下

heatmap子命令展示多个样本的CNV分布情况&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py heatmap *.cns

可视化结果示意如下

分布运行步骤繁琐&＃xff0c;上面的代码可以通过batch一个子命令搞定&＃xff0c;用法如下

cnvkit.py batch \

*Tumor.bam \

--normal *Normal.bam \

--targets my_baits.bed \

--annotate refFlat.txt \

--fasta hg19.fasta \

--access access.hg19.bed \

--output-reference my_reference.cnn \

--output-dir results/ \

--diagram --scatter

以上就是cnvkit的基本用法&＃xff0c;更多细节请参考官方文档。

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