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如何设计引物?

本文主要介绍关于引物设计软件的知识点,对【引物设计软件_干货|技能篇之分子生物学常用小软件分享】和【如何设计引物?】有兴趣的朋友可以看下由【weixin_39959615】投稿的技术文章,希望该技术和

本文主要介绍关于引物设计软件的知识点,对【引物设计软件_干货|技能篇之分子生物学常用小软件分享】和【如何设计引物?】有兴趣的朋友可以看下由【weixin_39959615】投稿的技术文章,希望该技术和经验能帮到你解决你所遇的【】相关技术问题。

如何设计引物?

1. PCR 引物设计-Primer Primer

Primer Premier 是一款由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR 或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件。其主要界面是分为序列编辑窗口(Genetank),引物设计窗口(Primer Design),酶切分析窗口(Restriction Sites)和 Motif 分析窗口。

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图1 primer-design

Primer Premier 软件的主要功能分四种:引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。此外,该软件还有一些特殊功能:简并引物设计,序列"朗读"、DNA 与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。

目前最常用的版本是 Primer Primer5.0,新版已更新到6.24且更加智能。其实小编也只是用过比较常规的模板,比如常规 PCR 引物设计。更多的功能还希望同学们多多留言与我一起分享心得。

在这里推荐几个常用的引物设计网站:

① Primer3/Primer3Plus — 使用广泛、操作简单

② Primer-BLAST — NCBI 的引物设计和特异性检验工具

用于在线设计聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物,这个工具同时兼具了Primer3 和 NCBI 的 Blast 功能。

③ GeneFisher —简并引物的设计工具

引物设计的注意事项

① 引物的长度一般为15-30 bp,最好在18~24 bp,因为太短易形成错配(False priming) 降低特异性,而太长也会降低特异性,并且降低产量。

② 引物在模板内最好具有单一性,也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端,一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

③ 引物序列的 GC 含量最好在40%一60%,且上下游引物序列 GC 含量的差异不要太大,3’端最后5个碱基最好不要富含 GC,特别是连续3个的 G 或 C。

④ 引物所在的模板区域应该位于外显子区,最好跨越一个内含子区,这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

⑤ 如果以 DNA 为模板设计引物,产物长度在100—600 bp 比较理想。而以 mRNA 为模板设计引物时,产物长度在150—300 bp 比较理想。

⑥ 5’ 端对 PCR 影响不太大,可以引进修饰位点和标记物。

2. 质粒图谱查询 — Vector NTI

Vector NTI Advance 11.5 是目前整合度最高,使用的最高的多功能桌面序列分析软件包,包含了一整套数据分析和管理的工具。可以查看质粒图谱查看和编辑、序列比对等。

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图2 Vector NTI Advance

和 Primer Premier 5 一样,是很多的分子生物学实验室的标配。

3. 质粒图谱查询 — Snapgene

Snapgene 可以做质粒图谱、直观的查找酶切位点、标记基因片段属性、直观查看引物所在位置,查看开放阅读框所编码氨基酸,还可以进行多序列比对、自动引物设计、支持 Gibson Assembly、直接导入 Genbank 序列号等。当然正版软件价格也很贵,单一授权$350/年,或$750/永久。

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图3 融合克隆模拟--质粒图谱分析

Snapgene 功能十分强大,比如可以用来模拟建立克隆,这使得我们设计建立克隆方案更加简便,如果克隆过程设计方案有缺陷,我们可以借助模拟发现并做出纠正。 Snapgene 可以模拟的标准限制性克隆,也可以模拟融合克隆。上图就是在 product 选项卡点击 Choose Overlapping PCR Primers,即可设计好引物,形成融合后的质粒图谱。

4. 蛋白相关

与核酸序列一样,蛋白质序列的检索往往是进行相关分析的第一步,由于数据库和网络技校术的发展,蛋白序列的检索是十分方便,将蛋白质序列数据库下载到本地检索和通过国际互联网进行检索均是可行的。

① 由 NCBI 检索蛋白质序列

ncbi.nlm.nih.gov:80/entrz/query.fcgi?db=protein

② 利用 SRS 系统从 EMBL 检索蛋白质序列

srs.ebi.ac.uk,可利用 EMBL 的 SRS 系统进行蛋白质序列的检索。

③ 蛋白质功能预测

基于 NCBI/BLAST软件的蛋白序列同源性分析类似于核酸序列同源性分析,可以直接将待分析的蛋白质序列输入 NCBI/BLAST (ncbi.nlm.gov/blast),选择程序 BLASTP进行分析。

5. 数据分析 - Origin

Origin,也有小伙伴叫它橙子,是由 OriginLab 公司开发的一个科学绘图、数据分析软件,只支持在 Microsoft Windows下运行,支持各种各样的 2D/3D 图形。Origin 中的数据分析功能包括统计,信号处理,曲线拟合以及峰值分析;支持多种格式的数据,包括 ASCII、Excel、DIADem、NetCDF、SPC 等等。曲线拟合是采用基于 Levernberg-Marquardt 算法(LMA)的非线性最小二乘法拟合。翻译过来就是操作简单,页面简洁,适合初学者使用。

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图4 Origin

不过,因为 Origin 的专案档(.pro)是封闭格式,并且只支援 Windows 这个操作系统,是其较大的缺点。因此网络上也有不少免费及开源或自由软件实作出类似功能的软件。其中以 LabPlot(基于 KDE 函式库)以及 QtiPlot(基于 QT 开发的)为较为知名的同类软件,因此在实验室数据分析方面的工作,小伙伴也可以考虑这两套软件。

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许雅惠嘉文意芝
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